超滤离心管作业工艺流程

　　1、选择合适的超滤管主要考虑分子量和浓度：通常靶蛋白的分子量不应大于靶蛋白分子量的1/3。例如，当靶蛋白的分子量为35kDa时，可以选择靶蛋白分子量为10kDa的超滤管。如果靶蛋白的分子量约为10kd，则可使用分子量为3kd的超滤管。

　　2、新购买的超滤是干燥的：使用前加入Milliq水。水的体积*覆盖在膜上，冰浴或冰箱被预先冷却几分钟。倒出水后，可以加入蛋白质溶液。蛋白质添加量不超过管顶白线。超滤管在加入蛋白质溶液前需要在冰上预先冷却。

　　3、平衡：质量和重心都应该平衡。注意速度和加速度不要太快，否则会直接损坏超滤膜。开始离心超滤（离心预冷至4度）。膜和旋转轴的方向根据说明进行调整（对于角向离心机，膜垂直于轴）。在实际应用中，一般的速度开度比手动低，可以延长离心管的使用寿命。

　　4、当浓缩到剩余的1毫升时，取50μl布拉德福德溶液，加10μl流过，看是否变蓝，以判断UF管是否漏蛋白。如果管道泄漏，重新倒入上层，然后流过新管道开始超滤。为了准确确定管道是否泄漏，用5mg/mlBSA离心10分钟，然后将其穿过，大致运行胶水或Bradford，继续添加剩余的蛋白质溶液以浓缩（在冰上操作以防止蛋白质加热），直到所有浓缩物都添加完毕。离心过程中应注意是否有蛋白质沉淀，导致堵塞。如果发生沉淀，有必要确定沉淀的具体原因是蛋白质浓度过高还是缓冲液不当。前者可以通过多个超滤管同时超滤来降低浓度，而后者通过改变不同的缓冲液直到没有蛋白质沉淀。

　　5、前几步是用来浓缩蛋白质的，如果要更换缓冲液，当总蛋白溶液浓缩到1毫升左右时，轻轻添加一个新的缓冲液（用0.22um超滤膜超滤后），然后连续浓缩到1毫升左右。浓缩液的终体积取决于所需的蛋白质浓度，通常不超过500ul，但也要浓缩到200ul以下。根据每次至少10次的体积浓度计算，1000次以上的3次基本可以达到更换缓冲器的目的。

　　6、提取终浓缩蛋白的操作在冰上进行。黄色枪头（200ul）用于提取终的蛋白质浓缩物。枪头沿枪头边缘轻轻插入。将蛋白溶液轻轻吹匀。注意不要触摸超滤膜。吸取浓缩液，一次多吸200ul，直至耗尽。后留在管底的浓缩液不需要吸收，否则太困难，可能损坏超滤膜。后，在无超滤膜的超滤管中加入Milliq水，以防止超滤膜干燥。

　　7、将超滤管中的水倒出来，用Milliq水轻轻冲洗几次。（如管底有可见蛋白质沉淀，可先加水，再用枪头吹气，注意不要碰触膜，吹气至沉淀悬浮，再倒出，不要冲自来水）然后加入0.2mNaOH溶液，室温放置20分钟，平衡超滤。在此期间定量管离心10分钟，倒出剩余的NaOH溶液，将管芯浸入Milliq烧杯（1L或2L）中。放置数小时，然后用新水替换，放置数小时，不断稀释NaOH浓度。50ml管道和盖子用自来水冲洗，内壁用Milliq水冲洗。

　　8、取出浸入水中的芯，并将其加入几乎满毫升的水中。在50毫升试管中注入毫升水。慢慢地将芯放入50毫升离心管中，排出一些水。然后盖上盖子，4摄氏度存放，直到下次使用。一般来说，根据上述步骤和注意事项，每根渠道在三到四年内不会受损。